ELISA實驗樣本處理及注意事項

血清是檢體中最常見樣本，如抗體、生化、激素、血藥濃度等項目均需要用到血清，然而其質量確實是不可忽視的問題，溶血、脂血、黃疸都會一定程度上影響檢測結果

1． 全血采集

量約為要求血清量的2-2.5倍（如：血清要求1ml，需采集全血2-2.5ml）

2. 血清分離

全血存放的容器決定分離的是血清還是血漿；促凝管和空白管存放全血經血液凝固后離心分出的上清是血清；若放入EDTA抗凝管或者肝素抗凝管，離心后分出的上清稱為血漿（如圖1）

備注：血清主要區別于血漿的是有血液凝固的過程和纖維蛋白的析出

3. 血漿是否可以替代血清進行送檢？

多數項目中血漿樣本可以替代血清，前提是該檢測項目不受抗凝劑成分和凝血因子的影響（如抗體類項目），但生化項目則不可用EDTA抗凝分離血漿，因為EDTA-2K此種抗凝劑不僅可以絡合重金屬Mg2+，也會致使K+的含量上升，故生化項目的最佳樣本是血清

4．什么樣的血清樣本不合格？

溶血、脂血（乳糜血）、黃疸（若是病理性原因很難消除）屬于不合格的樣本

5. 血清質量是怎樣影響檢測的？

1）溶血：紅細胞的破裂會引起血漿成分的改變，對一些生化項目如谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶、鉀的測定結果造成較大的影響。若進行抗體類檢測本身血清的顏色會干擾到最終的酶標儀讀數。

2）脂血：在運用比色法和比濁法檢測的項目中，脂血中的乳糜微粒具有散射光的特性不能通過雙波長進行消除從而影響檢測結果。

3）黃疸：黃疸的血清中含有膽紅素，若樣本放置時間過長或通過氧化劑后膽紅素還可被氧化為膽綠素、膽褐素，這些色素在不同波長范圍具有一定的光吸收，從而影響檢驗結果。

6.組織勻漿：

用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推 薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑（10mg組織+100微升PBS+10微升蛋白酶抑制劑）)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻 漿液進行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。

7.細胞提取液：

貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μL PBS重懸并通過反 復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

超聲波破碎條件：用20kHz頻率，150W的功率，在冰浴中進行超聲波破碎，每破碎2s，間隔3s，反復破碎三次。

反復凍融：收集細胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-20℃ 冷凍30 min，37℃解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液。

?